供體細胞——克隆成功的關(guān)鍵

體細胞核移植技術(shù)被廣泛應用于生產(chǎn)轉基因動(dòng)物，尤其是基因修飾大動(dòng)物。供體細胞提供克隆胚胎的主要遺傳物質(zhì)，是體細胞克隆成功與否的關(guān)鍵因素之一。供體細胞的細胞形態(tài)、周期、活性以及供體的個(gè)體差異、性別年齡等都會(huì )對克隆效率有影響。正常機體的自由基氧化作用與抗氧化防御作用處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)。外界環(huán)境刺激和機體內氧化反應代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量活性氧（Reactiveoxygenspe-cies，ROS），對酶及轉錄因子的活化、mRNA表達等有較大的影響。有研究結果顯示SOD及CAT基因的mRNA表達水平出現改變，這可能與細胞抵抗外來(lái)刺激有關(guān)，但細胞的抗氧化能力是否發(fā)生改變，更準確的應該在翻譯水平上對SOD及CAT基因的活性進(jìn)行檢測。ROS對細胞膜或者DNA產(chǎn)生傷害，促使凋亡相關(guān)基因表達的改變而引發(fā)細胞凋亡。Bcl-2蛋白家族與p53基因是重要的細胞凋亡調節因子，兩者相互作用，調控細胞凋亡。當Bcl-2和Bax基因形成異源二聚體比例增加時(shí)，抑制細胞凋亡。結果顯示，G418處理后細胞Bcl-2/Bax基因的比例有所提高，促凋亡基因p53的表達量下調，這可能是細胞自身應對G418所帶來(lái)的外來(lái)刺激而產(chǎn)生的一種自我保護，通過(guò)調節自身基因的表達，抑制細胞發(fā)生凋亡。

在體細胞核移植中，DNA甲基化是調控供體核內重編程的一種方式，對恢復細胞的性、提高體細胞核轉移的效率具有重要意義。哺乳動(dòng)物基因組中，轉座元件占到了50%左右，LINE是轉座元件中所占比例大的一種類(lèi)型。LINE-1是LINE中的主要類(lèi)型，在染色體中散在分布，約占小鼠和人類(lèi)基因組的17%～20%。微衛星是真核生物基因組重復序列中的主要組成部分，隨機、廣泛地分布于基因組中，大約占到豬全基因組的0.85%。因此LINE-1和微衛星的甲基化水平基本可代表整個(gè)基因組的甲基化水平。Dnmt1和Dnmt3a分別是維持DNA甲基化和從頭甲基化的關(guān)鍵酶。研究表明，敲除小鼠的Dnmt1基因，會(huì )導致嚴重的基因組去甲基化或胚胎死亡;敲除Dnmt3a基因，小鼠在出生后4周內死亡。研究發(fā)現，經(jīng)G418處理后，核供體細胞的Dnmt1和Dnmt3a基因的mRNA表達量均顯著(zhù)下調，表明G418會(huì )影響細胞內重要DNA甲基轉移酶的mRNA表達，但不影響細胞整體甲基化水平G418處理核供體細胞對豬克隆胚胎體外發(fā)育效率的影響。71本研究經(jīng)高質(zhì)量濃度G418處理后的供體細胞進(jìn)行核移植所獲得的重構胚的融合率、卵裂率和囊胚率均顯著(zhù)低于對照組，而囊胚細胞總數沒(méi)有顯著(zhù)差異。這說(shuō)明供體基因組的整體甲基化水平與克隆胚胎的發(fā)育能力可能沒(méi)有必然。這可能是核移植之后G418的毒性作用仍然存在于細胞內，從而影響了細胞生長(cháng)及克隆胚胎的發(fā)育性能。顧曉龍等利用RG108處理供體細胞并進(jìn)行甲基化水平的檢測，發(fā)現供體細胞整體甲基化水平的改變可能對提高核移植效率沒(méi)有直接影響。Bonk等使用低密度甲基化芯片技術(shù)檢測克隆供體細胞、精子、克隆囊胚、體內囊胚等的甲基化水平，同樣發(fā)現供體細胞整體甲基化水平的差異并非體外生產(chǎn)的囊胚發(fā)育率低下的主要原因，而某些區域特定的DNA甲基化修飾才是促進(jìn)重構胚胎發(fā)育的關(guān)鍵。