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    氣相液氮罐的應用與疾病生物樣本庫建設與管理

    點(diǎn)擊次數:1037 更新時(shí)間:2017-12-06

     

          大數據時(shí)代加上現金炙手可熱的細胞治療。研究者更關(guān)注樣本的生物信息數據與疾病臨床信息的相關(guān)性,通過(guò)大樣本的關(guān)聯(lián)分析,來(lái)預測疾病的發(fā)生、發(fā)展與轉歸。疾病生物樣品庫便是關(guān)聯(lián)疾病臨床信息與樣本生物信息的橋梁與核心,是生命科學(xué)基礎與臨床研究的關(guān)鍵源頭,是進(jìn)行大樣本驗證、快速實(shí)現生物醫藥轉化醫學(xué)的核心環(huán)節。近幾年,我國疾病生物樣本庫與轉化醫學(xué)得到政府與科學(xué)家們的高度關(guān)注、醫院領(lǐng)導與專(zhuān)家們的高度重視、企業(yè)與技術(shù)部門(mén)大力支持,廣大科研、醫務(wù)工作者的積極響應,呈現良好發(fā)展勢頭。從樣本資源來(lái)說(shuō),中國大的特點(diǎn)是樣本資源量大,資源種類(lèi)多樣化。在中國一個(gè)月的就診數量,在國外達到同樣的病例數可能要幾個(gè)月,如胸腺腫瘤類(lèi),據說(shuō)整個(gè)歐洲的例數甚至少于中國的一家*專(zhuān)科醫院。目前,我國生物樣本庫有專(zhuān)家庫、科室庫、多學(xué)科庫、重大項目庫、醫院庫、區域庫等,不少醫院(尤其*醫院)紛紛著(zhù)手建立自己的樣本庫,其中有精品庫、價(jià)值庫、特色庫,也有不少垃圾庫、死庫。

    疾病生物樣本庫建設

          建設樣本庫的基本原則建樣本庫是安全、準確、便捷。其中安全包括樣本生物安全、樣本信息安全、設備運行安全;準確包括樣本信息準確、樣本存放取出位置準確;便捷包括工作流程便捷、軟件系統操作便捷、信息交流便捷、硬件軟件耗材供應及便捷。樣本庫通常由基礎設施、凍存設備——主要由氣相液氮罐構成、凍存耗材、編碼及讀碼設備、監控設備、管理軟件和人員配置構成。合理的架構及流程可以保證樣本庫運行安全、準確、便捷。

    基礎設施

          基礎設施一般包括質(zhì)檢室、樣本處理室、冰箱室、氣相液氮罐設備室、監控室、空調設備、備份電源等。其中需要注意的是:冰箱是產(chǎn)熱設備,需要和液氮設備分開(kāi)放置。立式冰箱如不能背靠墻擺放,可保持一定距離背對背擺放??紤]到超低溫冰箱目前仍是組織庫的主要存儲設備,在運行過(guò)程中會(huì )大量產(chǎn)熱,配備樣本庫空調時(shí)對其功率和性能可靠性需要給予足夠的考慮。備份電源也是樣本庫的基本配備。在供電不夠十分穩定的地區,在選擇冰箱時(shí)還要考慮到冰箱的溫度絕緣性(即滿(mǎn)載樣品時(shí)斷電后溫度上升的速度)。當樣本容量足夠大時(shí),還需要考慮使用自動(dòng)化取放樣品的設備。對于特別重要的樣本,條件許可的情況下可以將樣本的備份分開(kāi)放置于不同的物理地點(diǎn)以增加安全性。

    基本設備

    ⑴-80度凍存設備(超低溫冰箱):超低溫冰箱穩定工作的溫度通常在-800C左右,在取放樣品的時(shí)候很容易升至-600C的再結晶溫度范圍,容易造成樣本生物穩定性的衰減。所以在選用超低溫冰箱的時(shí)候制冷能力(速度)是一個(gè)關(guān)鍵參數。制冷能力強的冰箱能夠在溫度受到擾動(dòng)的,快速降至設定的溫度以盡量減少對樣本的傷害。另外,由于樣本庫的目的是長(cháng)期存放樣品,超低溫冰箱需要在滿(mǎn)載情況下多年不間斷運行,對其可靠性和溫度穩定性都比普通實(shí)驗室的要求要高。樣本庫的冰箱需要有運行溫度的連續記錄功能,以便追蹤溫度波動(dòng)。

    ⑵-140度凍存設備(氣相液氮罐和深冷冰箱):氣相液氮罐和深冷冰箱是實(shí)現-1400C長(cháng)期樣品儲存的常用設備。這兩種方法因為不存在液氮進(jìn)入樣本內的風(fēng)險,因而儲藏期間沒(méi)有樣本間交叉感染的危險。深冷冰箱是相對較新的一種設備,從近幾年的客戶(hù)使用反饋來(lái)看,在滿(mǎn)載樣品的情況下能夠實(shí)現-140~-1500C的穩定環(huán)境,得到了越來(lái)越多的應用。氣相液氮罐是更受廣泛認可的方法,美國國家癌癥協(xié)會(huì )等機構的樣本庫操作規范文件中均推薦使用氣相液氮罐長(cháng)期儲存組織樣本。氣相液氮罐是在液氮容器中加入一定量液氮,樣本儲存在容器中不與液氮直接接觸的空間。液氮容器內氣相區間的溫度低(容器口處)不高于-1400C。較少的樣本量可以使用液氮罐儲存,盡量使用適配凍存盒的液氮罐消耗的液氮量較大一些,但由于其取放樣品的便捷以及樣品不易落入液氮罐的特點(diǎn),越來(lái)越多的液氮罐用戶(hù)采用了這類(lèi)配置。大量的樣本對取放的便捷性及液氮加注自動(dòng)化要求更高,目前主要使用液氮儲存箱。通常需要液氮自動(dòng)檢測設備和自動(dòng)加注設備,包括液氮供應罐、液氮塔和液氮管道等。

    ⑶-196度凍存設備(液氮罐和液氮儲存箱):液氮罐能使樣本維持在-1960C的低溫,是目前技術(shù)條件下所能達到的佳樣本庫保存溫度。與氣相液氮罐相比液氮液相更易實(shí)施,液氮罐內可裝滿(mǎn)液氮,儲存更多的樣本,但對盛裝樣本的凍存管等耗材的要求更高。凍存造血干細胞的血袋可以直接在液氮內儲存,但凍存管不能直接放入液氮內儲存,需要經(jīng)過(guò)處理,要求嚴格的可使用凍存管套對凍存管全身密封,這一方法需要更高的凍存盒和更大間隔的凍存架。簡(jiǎn)易方法是可使用密封膜對凍存管管帽和管身接合處密封,一些常用10x10底部間隔的凍存盒即可兼容,不需要特殊的凍存管架。從目前客戶(hù)的反應以及文獻來(lái)看,這一方法雖然簡(jiǎn)易,但效果還比較可靠。

    監控設備

          監控設備包括冰箱溫度探頭、冰箱運行溫度記錄,液氮罐液位監控、遠程報警、視頻監控等。超低溫冰箱和深冷冰箱都需要實(shí)時(shí)監控溫度。盡管很多廠(chǎng)家在設備上有溫度測量和數據輸出裝置,不少用戶(hù)選擇另行安裝溫度探頭單獨監控溫度。溫度探頭的位置建議放于冰箱溫度高的底部區域以確保樣品安全。冰箱的運行溫度記錄也是基本的要求。遠程報警系統目前常用報警結合網(wǎng)絡(luò )報警。溫度探測裝置會(huì )將超過(guò)正常溫度范圍的警報通過(guò)在冰箱等設備中預制的SIM卡自動(dòng)給相關(guān)管理人員短信實(shí)時(shí)報警,同時(shí)相關(guān)信息也會(huì )通過(guò)互聯(lián)網(wǎng)或數據線(xiàn)向管理軟件系統報警。近年來(lái)視頻監控逐漸成為很多實(shí)驗室的常規配置,除了在走廊、出口等處安置常規攝像頭監控外,在樣品處理、冷凍等關(guān)鍵操作環(huán)節安置可調焦距的高分辨率攝像頭可以遠程實(shí)時(shí)監控并記錄操作人員的操作細節是否規范,對加強人員管理保證樣品質(zhì)量很有幫助。

    其它設備

          樣本庫通常還需要進(jìn)行一定的樣品運輸和轉移。-20度樣本轉移一般用冷凝膠包(Gel pack),-700C用干冰,-1500C以下用液氮運輸罐。為避免包裹遞送因意外原因延誤,樣本包裝里需要配備至少24小時(shí)的制冷劑余量。凍存管架直接影響容器樣本存儲能力,需要根凍存設備、耗材的類(lèi)型具體選用或定制。樣本量特別大的庫還可能用到自動(dòng)化存取設備,這一方案目前只和-800C設備配套使用,需要使用特定的管理軟件凍存設備。

          所有來(lái)源于人的樣本都被認為是具有潛在感染性和有害的,必須經(jīng)過(guò)相關(guān)病原體檢驗和相應處理才能入庫。樣品處理必須在生物安全柜內進(jìn)行。生物安全柜能實(shí)現對樣本潔凈性以及操作者和環(huán)境的同時(shí)保護,但超凈臺的風(fēng)是由里到外吹的,只能保護樣本的潔凈性,不能保護操作者和環(huán)境免受潛在病原體的危害。

    凍存耗材

          與普通實(shí)驗室相比,樣本庫的樣品保存時(shí)間更長(cháng),對樣本中各種成份穩定性和完整性的保護要求更嚴格,使用數量更大,因此對耗材的性能特點(diǎn)及規格挑選有更高的要求。

          目前樣本庫常用的樣本存儲耗材是1~5 ml的凍存管,其中2 ml的凍存管是常用,有些廠(chǎng)家把實(shí)際容量2 ml和5 ml的凍存管分別標稱(chēng)為1.8 ml和4.5 ml的工作容量以提醒使用者不要裝滿(mǎn),防止液體冷凍是體積增加破壞密封性。除了常規單個(gè)使用的凍存管,還有一些按96孔板大小整版存放的凍存管,使用專(zhuān)門(mén)設計的形狀和管蓋,以便使用自動(dòng)化機械手臂操作。

          由于聚丙烯(Polypropylene, PP)能夠耐受低溫(-1960C),具有相對較低的液氮滲透性和較好的化學(xué)試劑耐受性(如DMSO),因此聚丙烯被為普遍的用于制作凍存管。凍存管作為生物樣本儲存過(guò)程中直接與樣品接觸的物質(zhì),其原材料的可靠性級別也直接影響了所裝載物質(zhì)的安全性。聚丙烯材料的級別可基本從四個(gè)方面去判斷:純凈性、無(wú)菌性、化學(xué)耐受性和對生物分子(細胞、蛋白、RNA和DNA等)的吸附性。

           美國藥典(USP)將塑料等級分為6級,其中6級塑料需進(jìn)行多項與細胞接觸性反應測試,以確保其對細胞的毒性低,可用于醫療器械產(chǎn)品的制備。因此在樣本儲存中建議盡量選用的塑料凍存管為超純醫用級原始樹(shù)脂,并能通過(guò)USP Class VI的測試。長(cháng)期儲存過(guò)程中凍存管材對生物大分子的吸附性是十分重要的考慮因素。對血樣,尤其是提純的微量生物大分子樣本來(lái)說(shuō),普通的塑料管材容易在長(cháng)期儲存中因吸附而造成樣本內某些生物大分子濃度降低,破壞樣本的完整性。因此樣本庫中建議使用的性能可靠的凍存管,不建議使用微量離心管等非耗材。另外為了更好地長(cháng)期保持密封性,美國國家腫瘤協(xié)會(huì )組織庫建議使用帶有螺紋密封的凍存管,不建議使用插拔式或者彈出蓋子式的耗材。凍存管的螺旋有內旋和外旋之分,外旋是為超低溫冰箱設計的,內旋是為更低的溫度比如液氮氣相或深冷冰箱設計的。但液氮內直接存放凍存管需要對凍存管進(jìn)行進(jìn)一步的防護,以免液氮泄露。液氮泄露進(jìn)凍存管不僅容易造成凍存管在化凍時(shí)爆炸破壞樣品并危及操作者,更嚴重的后果是造成樣本間交叉感染。凍存管的無(wú)菌程度也是一個(gè)重要指標,尤其是對于將來(lái)可能用于臨床使用的樣本,盡可能滿(mǎn)足或者接近2010年新版中國藥典對耗材的要求(SAL 10-6)。

          對于一些體積較大的樣本,目前市面上Nalgene有一款15ml的廣口無(wú)菌凍存管可用于5-15ml的液體或者較大的組織器官儲存。更大的液體體積可以使用血袋。廣口無(wú)菌凍存管和血袋能夠耐受-1960C低溫。

    樣本管理信息化

          普通實(shí)驗室手寫(xiě)標記的凍存管已經(jīng)很難滿(mǎn)足樣本庫的大容量?jì)龃嫘枨?。一種常見(jiàn)的解決方案是現場(chǎng)編輯并打印一維或者二維編碼及樣本信息,然后手工粘貼到普通凍存管上。另一種解決方案是選擇廠(chǎng)家激光蝕刻了二維編碼的凍存管。從編碼的識別性和牢固度等多種角度比較兩種方案,后一種方案在實(shí)際應用的優(yōu)點(diǎn)是顯而易見(jiàn)的,也是目前發(fā)展的方向。預設二維碼的耗材成本整體來(lái)看高于現場(chǎng)打印編碼方案,但打印編碼的方案對標簽紙張、打印質(zhì)量、粘合劑都有特殊的要求,需要耐受長(cháng)期低溫儲存及一定的濕度,普通打印紙和普通油墨容易發(fā)生標簽脫落、字跡模糊和油墨成本如鉛等污染樣本。這些額外的成本甚至能和普通凍存管價(jià)格相當,需要在做預算的時(shí)候加以充分考慮。紙質(zhì)的凍存盒是普通實(shí)驗室早期使用的凍存盒,近年來(lái)已經(jīng)被聚碳酸酯的凍存盒替代,尤其是在-1400C以下的溫度。樣本庫對穩定性可靠性的要求比一般實(shí)驗室更高,建議使用聚碳酸酯的凍存盒,有些聚碳酸酯的凍存盒在需要的情況下還可以高溫高壓滅菌。有些標準尺寸的聚碳酸酯凍存盒使用底部柱形間隔可以放置10x10個(gè)2 ml或2 ml 以下外旋或者內旋凍存管。同樣外部尺寸的紙質(zhì)凍存盒的間隔設計通常只能放置9X9個(gè)2 ml外旋或內旋凍存管。

           在樣本庫潛在樣本容量較大的情況下,需要使用二維編碼,這時(shí)預制二維編碼就體現出了難以替代的優(yōu)點(diǎn)。首先紙質(zhì)標簽上打印的二維編碼經(jīng)過(guò)長(cháng)期冷凍之后識別率比較低,因此目前使用的一維和二維混合打印編碼的標簽實(shí)際上主要還是依賴(lài)一位編碼提供可靠識別。其次預制二維編碼管能夠實(shí)現快速讀碼,更能滿(mǎn)足樣本庫高通量需求。預制二維碼的凍存管采用96孔板的儲存格式(SBS footprint),可使用自動(dòng)化讀碼儀一次性從底部讀取整板上所有的凍存管,從而盡量減少取樣時(shí)間,降低讀碼取樣過(guò)程中樣品升溫造成的傷害。

          由于不同的樣本庫在編碼讀碼設備、監控設備、冷凍設備、耗材、樣本容量等方面有較大的差異,管理軟件通常是根據用戶(hù)的具體配置和要求量身定做的,有些情況下還需要與實(shí)驗室其他管理軟件整合,并在后期的使用中根據需求和反饋進(jìn)一步改進(jìn)。由于管理軟件、設備及耗材編碼設備為一個(gè)整體系統,所以在選擇軟件時(shí)應考慮系統兼容性。軟件對監控設備、報警設備的整合、界面友好程度、可擴展性和穩定性也都是重要考慮因素。另外管理軟件中對樣本信息需要設置管理權限以保證樣本來(lái)源的隱私。管理軟件有設備/耗材廠(chǎng)家配套提供的,第三方軟件公司提供的,也有樣本庫根據自己的需求自行制作。

           疾病生物樣本數據庫作為大數據時(shí)代重要的資源,對疾病的發(fā)生、發(fā)展、轉歸以及治療的研究意義重大。實(shí)現樣本庫的質(zhì)量管理、信息數據結構化與標準化數據共享將是大數據時(shí)代樣本庫建設的三項關(guān)鍵任務(wù)。其中,疾病生物樣本及其信息的質(zhì)量管理將決定并影響研究的結果。因此,實(shí)現疾病生物樣本的質(zhì)量管理制度以及相關(guān)質(zhì)量檢測方法,實(shí)現樣本庫質(zhì)量的持續改進(jìn),將有助于疾病研究的發(fā)展。

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